腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV-A71）為嗜神經性病毒，屬於小RNA病毒科腸道病毒屬，是手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD）的主要病原體之一[1]。手足口病是一種全球性疾病，部分患者可引起多種中樞神經係統並發症，甚至致命性死亡[2, 3]。然而，目前還沒有臨床獲批的針對EV-A71的抗病毒藥物。腸道病毒與宿主因子的研究尚不完全明確，揭示關鍵宿主因子的作用機製研究可能為腸道病毒特異性藥物的研發提供重要線索。
宿主蛋白激酶介導的細胞信號傳導在許多病原體的複製和繁殖中發揮重要作用。先前狗万外围充值 王鵬飛團隊和香港大學周婕團隊合作於Journal of Medical Virology在線發表了題為 “Rock1 is a novel host dependency factor of human enterovirus A71: implication as a drug target”的研究論文，揭示了Rock1是EV-A71複製的新型宿主依賴因子，可作為開發抗EV-A71療法的靶標。近日，狗万外围充值 的王鵬飛/趙曉宇團隊在國際學術期刊Journal of Virology上發表題為“Vascular endothelial growth factor receptor 2 as a potential host target for the inhibition of enterovirus replication”的研究論文，發現帕唑帕尼（Pazopanib）具有廣譜抗腸道病毒的作用，並揭示VEGFR2可能是腸道病毒複製的潛在宿主依賴因子，可作為開發抗腸道病毒療法的靶標。
研究人員前期利用橫紋肌肉瘤（RD）細胞和二維腸道腸道類器官（2D intestinal organoids）篩選激酶數據庫，研究發現血管內皮生長因子受體（Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）家族的19個靶向性抑製劑，均表現出有效的抗病毒活性。基於此，研究人員推測VEGFR家族中可能含有腸道病毒複製和繁殖所需的關鍵宿主因子。其中，通過病毒減少實驗（Viral reduction assay），從病毒基因拷貝數、活病毒滴度以及免疫熒光染色等方麵，證明了Pazopanib對EV-A71的抑製作用呈現劑量依賴性效果（圖1），其選擇性指數高達254，甚至比已知有效的廣譜微小RNA病毒抑製劑吡羅達韋（Pirodavir）還要高出許多。
圖1 Pazopanib在RD細胞中對EV-A71的劑量依賴性抑製作用
同時，通過多種經典病毒學實驗證實Pazopanib能夠在體外抑製多輪病毒的複製，並在感染早期抑製病毒結構蛋白VP1的表達。此外，Pazopanib能夠抑製EV-A71在多種細胞中的複製，包括Huh-7、HepG2、Caco-2、HT-29、HEK-293T和Vero-E6細胞。並且，在Pazopanib的存在下，EV-A71介導的IL-6、IL-8和TNF-α誘導明顯減弱，提示Pazopanib可以抑製病毒誘導的促炎反應。隨後，研究人員發現Pazopanib對不同亞型腸道病毒的具有廣譜抗病毒效果，包括Enterovirus A的柯薩奇病毒A10型，Enterovirus B的柯薩奇病毒B1型，Enterovirus D的腸道病毒70型，以及人類鼻病毒A型，表明Pazopanib具有成為抗多種腸道病毒的廣譜抗病毒藥物的潛在價值（圖2）。接下來，研究人員通過藥物添加時間測定等實驗，初步判斷Pazopanib可能誘導宿主細胞的某些改變，從而阻礙病毒基因組複製和轉錄，而不是通過影響受體結合或抑製靶向病毒功能蛋白（如蛋白酶或聚合酶）的進入。
圖2 Pazopanib廣譜抑製多種腸道病毒的感染
值得注意的是，血管內皮生長因子（VEGF）其家族包含VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3三個受體。然而，由於 Pazopanib靶向所有亞型，因此參與 EV-A71 複製的特定基因仍未確定。因此，研究人員首先檢測了 EV-A71 感染後 RD 細胞中 VEGFR 的 mRNA表達情況。研究發現，在8和24 hpi 時，VEGFR2 的 mRNA 表達水平均顯著上調，但 VEGFR1 和 VEGFR3 的 mRNA 表達水平沒有顯著上調，這表明在 EV-A71 感染期間VEGFR2被激活。接下來，通過小幹擾RNA（siRNA）分別敲低以上三個受體基因進一步發現隻有VEGFR2基因敲低的細胞會顯著降低EV-A71病毒的複製。同時，過表達VEGFR2蛋白則增加了EV-A71在細胞中的複製，從而確定VEGFR家族中參與EV-A71複製和繁殖所需的關鍵宿主因子為VEGFR2（圖3）。
圖3 VEGFR2是EV-A71複製的潛在關鍵宿主因子
最後，通過轉錄組學及KEGG分析差異表達基因（DEGs）進一步探究Pazopanib的存在對EV-A71感染後的RD細胞內宿主因子的改變。研究發現，這些DEGs都與PI3K-Akt信號通路有關，表明Pazopanib可能通過調節下遊PI3K-Akt信號通路發揮其抗病毒作用（圖4）。隨後，使用Src抑製劑Dasatinib和Akt選擇性抑製劑MK-2206均能夠顯著抑製病毒EV-A71的複製，而EV-A71感染後導致的Akt磷酸化同樣能被Pazopanib抑製。更重要的是，免疫印跡實驗表明，EV-A71感染HUVEC後，會誘導磷酸化VEGFR2的增加。這些發現表明，VEGFR2可能是通過激活TSAd-Src-PI3K-Akt 信號通路影響EV-A71的感染。
圖4 轉錄組學分析EV-A71感染細胞中的差異表達基因
綜上，本研究證明VEGFR抑製劑Pazopanib不僅以劑量依賴性方式抑製 EV-A71 的複製，同時表現出廣譜抗腸道病毒活性。更重要的是，VEGFR2在細胞層麵的敲低和過表達分別抑製和促進EV-A7複製，表明VEGFR2可能是EV-A71複製的新型宿主依賴因子。此外，轉錄組分析進一步證明，VEGFR2可能通過TSAd-Src-PI3K-Akt通路在對抗EV-A71感染中發揮關鍵作用。本研究為預防和治療腸道病毒感染提供候選靶點，同時這些靶向VEGFR的抑製劑可作為治療腸道病毒感染的候選藥物，為腸道病毒的防治提供理論支持和實踐基礎。
狗万外围充值 感染與健康研究院青年研究員趙曉宇、廣州醫科大學教授趙金存和万博英超狼队网官方网 研究員王鵬飛是本文的共同通訊作者。狗万外围充值 感染與健康研究院青年研究員趙曉宇、万博英超狼队网官方网 博士生喬芮、狗万外围充值 粵港澳大灣區精準醫學研究院博士後郝萌和廈門大學公共衛生學院助理教授徐龍發是本文的共同一作。該研究得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、上海市啟明星計劃以及上海市浦江計劃等多項基金的資助的支持。
參考文獻
1. Yeung, M.L., et al., Human tryptophanyl-tRNA synthetase is an IFN-γ–inducible entry factor for Enterovirus. The Journal of Clinical Investigation, 2018. 128(11): p. 5163-5177.
2. Solomon, T., et al., Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71. Lancet Infect Dis, 2010. 10(11): p. 778-90.
3.McMinn, P., et al., Neurological manifestations of enterovirus 71 infection in children during an outbreak of hand, foot, and mouth disease in Western Australia. Clinical Infectious Diseases, 2001. 32(2): p. 236-242.